細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)（入門級(jí)）

總的原則：無(wú)菌操作、保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性

按時(shí)間順序整理

1、  細(xì)胞房和生物安全柜（或超凈工作臺(tái)）先開紫外照射30min。作用：對(duì)環(huán)境滅菌（空氣）。（備注：如果著急，至少也要開15分鐘）

在做實(shí)驗(yàn)之前考慮好需要哪些物品。開始照射之前，將所需要用到的物品都放到生物安全柜（或超凈工作臺(tái)）里面。

常用移液槍或電動(dòng)移液器等，需要在工作臺(tái)上放置一套設(shè)備。

細(xì)胞培養(yǎng)箱一般都已經(jīng)調(diào)整好。定期留意一下二氧化碳是否足夠。不夠及時(shí)更換。

2、  顯微鏡需要定期消毒酒精擦拭。注意：顯微鏡一般都放在細(xì)胞房。

3、  進(jìn)入實(shí)驗(yàn)之前，首先給自己帶上拖鞋、頭套，口罩，實(shí)驗(yàn)服，手套（手套帶雙層）。注意：手套要將袖口套進(jìn)去。實(shí)驗(yàn)服、拖鞋是細(xì)胞房。

4、  開始操作之前先觀察細(xì)胞。

首先觀察細(xì)胞培養(yǎng)液的顏色。現(xiàn)在的細(xì)胞培養(yǎng)液通常都放有酸堿指示劑（絕大部分是酚紅）。細(xì)胞在培養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中，不斷在培養(yǎng)液上清中累積酸性物質(zhì)，時(shí)間長(zhǎng)了，培養(yǎng)液變?yōu)辄S色（同時(shí)培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡）。

其次鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)是否良好，是否需要傳代。如果生長(zhǎng)狀態(tài)不好，需要對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行調(diào)整（一般是加大血清濃度）。過(guò)于密集出現(xiàn)大片融合或太密集而導(dǎo)致細(xì)胞脫落，則進(jìn)行傳代。

如果長(zhǎng)勢(shì)良好，且細(xì)胞培養(yǎng)液顏色未發(fā)生變化，可以酌情進(jìn)行1/2、 1/3、1/4換液，也可以全換液。總之，視細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定。

5、  細(xì)胞培養(yǎng)預(yù)準(zhǔn)備：

首先是準(zhǔn)備各種溶液。

1：是配制溶液過(guò)程中要用到的水。水用純水，高壓滅菌之后，再去內(nèi)毒素。去內(nèi)毒素方法很多，簡(jiǎn)單可以放在烘箱180度3小時(shí)?；蛘哌^(guò)去內(nèi)毒素的柱子后，高壓滅菌。

第二，各種溶液滅菌：

抗生素用去內(nèi)毒素水配制后，直接過(guò)濾除菌（過(guò)0.22u濾頭）?？梢杂靡淮涡詿o(wú)菌注射器過(guò)一次性0.22u濾頭。

現(xiàn)在用的培養(yǎng)液，如果是商業(yè)化液體培養(yǎng)基，不用處理。如果是粉末，需要用去內(nèi)毒素水在生物安全柜（或超凈工作臺(tái)）進(jìn)行配制，再過(guò)濾除菌?？梢韵扰錆饪s液（如10×），過(guò)濾除菌后。再用滅菌去內(nèi)毒素水稀釋成1×培養(yǎng)液。

第三，*培養(yǎng)液的配制：

培養(yǎng)液加上合適比例的血清即可。但血清一般保存于－20℃，一般解凍是放在4℃冰箱解凍，耗時(shí)長(zhǎng)，而且必須解決*之后，才能進(jìn)行*培養(yǎng)基的配制。所以要提前幾個(gè)小時(shí)就將血清從－20℃轉(zhuǎn)入4℃，以期*解凍。當(dāng)然如果這一次就需要用完的話（是指用這些血清配制的培養(yǎng)液都用完），也可以放到37℃解凍。

第四，醉重要的是保證過(guò)程中無(wú)菌。

液體必須要分裝。無(wú)論過(guò)程中用到的培養(yǎng)液、胰酶、血清、PBS、生理鹽水、抗生素盡量分裝。分裝是為了防止污染。如果操作有誤，僅能威脅到其中一支，而非整個(gè)。

培養(yǎng)液、血清、PBS、生理鹽水分裝為20mL、50mL或100mL/管

胰酶、抗生素可分裝為1mL/管。

分裝先于細(xì)胞操作

第五，操作之前，培養(yǎng)液先放到37度的細(xì)胞培養(yǎng)箱里復(fù)溫。原因：盡量減少對(duì)細(xì)胞的刺激。低溫對(duì)于細(xì)胞也是一個(gè)刺激因素。

第六，操作之前，大腦先過(guò)一遍此次操作所需要用到的所有用具。將所有用具先放到無(wú)菌臺(tái)面上。減少拿入拿出的動(dòng)作，保證無(wú)菌。（如果萬(wàn)一發(fā)現(xiàn)少拿了什么，也不要緊，再加上就是。如果是槍頭盒、移液管等用具，先用消毒酒精噴一下）。

第七，操作之前，帶著的手套先噴消毒酒精。然后再進(jìn)入工作臺(tái)。等一分鐘，等手套上的酒精揮發(fā)之后再進(jìn)行操作。

6、  細(xì)胞培養(yǎng)操作過(guò)程：

注意無(wú)菌。無(wú)論哪一管液體，開蓋后盡量立即關(guān)上（如果有幾瓶都需要開的，也注意，可以虛蓋）。蓋子向上放。操作時(shí)不要從開蓋的容器上方經(jīng)過(guò)。另外，無(wú)菌臺(tái)面上擺放的各種東西，是一字?jǐn)[開，平行于自己。盡量不要前后重疊

細(xì)胞操作中所用的所有耗材試劑都是細(xì)胞培養(yǎng)。一般都以一次性耗材居多。1ML槍頭為加長(zhǎng)型培養(yǎng)槍頭。移液管亦有10mL一次性無(wú)菌移液管

（1）細(xì)胞換液：

培養(yǎng)皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液。

（2）細(xì)胞傳代：

傳代之前先觀察，細(xì)胞是否密集，是否開始融合。一般融合達(dá)到70－80%就可以傳代。早點(diǎn)傳代也可以。

如果是貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞：

1）  培養(yǎng)皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養(yǎng)液；

2）  無(wú)菌PBS或無(wú)菌生理鹽水洗滌3次（按培養(yǎng)體積加入）；

3）  加入適量胰酶消化適當(dāng)時(shí)間（一般胰酶為0.25%；9cm/10cm培養(yǎng)皿和25cm培養(yǎng)瓶，一次加入1mL胰酶。消化時(shí)間視細(xì)胞類型等多種情況綜合考慮，一般如果是細(xì)胞株，非原代培養(yǎng)，消化1－2分鐘足矣）；

4）  用槍頭吹打數(shù)十次（視細(xì)胞類型而定。一般細(xì)胞株30－50次吧，耗時(shí)一般2分鐘左右）；

5）  加入適量體積*培養(yǎng)基終止胰酶消化（如果是9cm/10cm培養(yǎng)皿和25cm培養(yǎng)瓶，可以加入1mL*培養(yǎng)基；現(xiàn)在培養(yǎng)瓶（皿）里有2mL溶液）。

6）  現(xiàn)在可以將溶液進(jìn)行分瓶（2mL）。如果是細(xì)胞株，直接均分到兩個(gè)培養(yǎng)瓶（皿）里。如果是原代培養(yǎng)，可以根據(jù)消化時(shí)間來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離；因此可以將溶液（2mL）都轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶（皿）。

7）  將兩個(gè)培養(yǎng)瓶（皿）補(bǔ)足*培養(yǎng)基到正常體積（果是9cm/10cm培養(yǎng)皿和25cm培養(yǎng)瓶，為5mL*培養(yǎng)液）

8）  鏡下觀察。剛剛傳代細(xì)胞還沒貼壁，懸浮在溶液中，呈圓形。一般2h之內(nèi)會(huì)貼壁，如果已經(jīng)貼壁，根據(jù)細(xì)胞類型有不同的形態(tài)，但通常都不是圓形。

9）  鏡下觀察無(wú)誤之后，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。培養(yǎng)瓶（皿）放入之前，可以用消毒酒精先擦一下。

10）  傳代之后，第二天細(xì)胞換液一次。當(dāng)然，也可以視情況而定。

7、  收拾工作臺(tái)。物品歸位，倒出垃圾。再開紫外照射30min

8、  其它注意事項(xiàng)：

1:，經(jīng)常觀察。是每天都顯微鏡下看一看，確定細(xì)胞狀態(tài)。然后該換液換，該傳代傳，不用理會(huì)的就原樣放回去。如果好幾天都不想理會(huì)，可以放不*培養(yǎng)基，或者低血清濃度的培養(yǎng)液，維持細(xì)胞生存，但不增殖。

第二，是否加抗生素。這個(gè)視情況而定。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，是要求盡量少添加不相關(guān)的雜質(zhì)。抗生素對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)，也是一種負(fù)擔(dān)。但如果環(huán)境比較污染，直接添加好了。好比沒病不用吃藥，感冒了還是要吃藥；嬰兒沒病但還是要打疫苗。

第三，胎牛血清的解凍。血清一般保存于－20℃，要放在4℃冰箱解凍，耗時(shí)長(zhǎng)，500mL要好幾個(gè)小時(shí)，我們經(jīng)常是頭天離開實(shí)驗(yàn)室之前放到4℃冰箱，過(guò)夜。所以經(jīng)常分裝成10mL或者20mL。這樣，上午放到4℃冰箱，下午就可以用了。

第二，是否一定要細(xì)胞房。以及是否要*嚴(yán)格的遵守種種器具。這個(gè)吧，見仁見智。凡所有種種措施及設(shè)備都是為了保證培養(yǎng)操作過(guò)程中無(wú)菌，減少感染的機(jī)率；試劑耗材保證無(wú)菌無(wú)內(nèi)毒素。細(xì)胞房也是這么一個(gè)措施而已，其它試劑耗材也是；我們沒有專門的細(xì)胞房也這么養(yǎng)。

并不是說(shuō)走夜路就一定會(huì)遇到鬼，當(dāng)然走多了遲早遇到，如果總是遇不到，這個(gè)人運(yùn)氣一定很好——。

剛開始我們實(shí)驗(yàn)室也是沒有的生物安全柜和細(xì)胞房，拖鞋什么的也沒辦法，沒有加抗生素，照樣養(yǎng)得好好的。但是，交叉養(yǎng)，還是需要注意，一是時(shí)間上分隔開來(lái)：每天細(xì)胞培養(yǎng)先操作。其它細(xì)菌之類操作靠后，且操作后消毒酒精臺(tái)面消毒，紫外照射1小時(shí)。二是其它操作要小心，避免帶入污染。當(dāng)然，如果有必要加抗生素，還是盡早加，比細(xì)胞污染了再去搶救要來(lái)得好。

（算是順便整理了一下，屬于入門級(jí)別的。）

@geraldorjerry：你好，你的意思是紫外線照過(guò)之后，實(shí)驗(yàn)操作開始了，如果萬(wàn)一發(fā)現(xiàn)少拿了什么，就直接酒精噴一下再放進(jìn)去是嗎

@llh1245：有時(shí)確實(shí)是忘記，ZUI怕的就是那種實(shí)驗(yàn)已經(jīng)做到一半忘記了的，或者發(fā)現(xiàn)東西不夠用的。我們一般是這樣處理：耗材、移液槍還有金屬器皿之類的，可以噴一下酒精放進(jìn)來(lái)，等酒精風(fēng)干一下，注意不要和其它東西混雜。反正一般細(xì)胞的也有外包裝，里面已經(jīng)是無(wú)菌無(wú)內(nèi)毒素。如果是試劑，那就是直接從冰箱拿出來(lái)放進(jìn)來(lái)就是。（如果只是實(shí)驗(yàn)還沒有真的開始，把漏掉的東西加上，再照30分鐘就是。）

@姚麗佳：請(qǐng)問傳代前，經(jīng)過(guò)胰酶處理后，加了培養(yǎng)基后不用離心直接分瓶嗎？那后面培養(yǎng)的時(shí)候不就含有胰蛋白酶了嗎？不會(huì)產(chǎn)生影響嗎？

@llh1245：是的，不用離心直接分瓶。之后加入含血清的培養(yǎng)基中止了胰酶作用。如果是貼壁細(xì)胞，一般第二天就貼壁了。分瓶后第二天再全部換液。如果是半懸浮細(xì)胞，一般都不用胰酶消化，都是直接吹下來(lái)。