取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。

　　2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)， 是否應(yīng)馬上去除DMSO?

　　除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO 敏感之細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞)， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。

　　3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基?

　　不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無(wú)法存活。

　　4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類(lèi)?

　　不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源， 所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。

　　5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

　　FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼， 請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

　　6 培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 % 或10% CO2?或根本沒(méi)有影響?

　　一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 % CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí)， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。

　　7 何時(shí)須更換培養(yǎng)基?

　　視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

　　8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素? 除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

　　9 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度?應(yīng)如何處理?

　　一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第1次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中， 保存于–20 °C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。

　　10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理?

　　一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時(shí)， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度， 重復(fù)前述步驟即可。

　　11 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?

　　欲回收動(dòng)物細(xì)胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過(guò)高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡。

　　12 細(xì)胞之接種密度為何? 依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤(pán)之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。

　　13 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何?

　　動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中， 必須使用前先行配制完成。

　　14 DMSO 之等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何?

　　冷凍保存使用之DMSO 等級(jí)， 必須為T(mén)issue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無(wú)菌狀況， 第1次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中， 保存于4°C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。

　　15 冷凍保存細(xì)胞之方法?

　　冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

　　冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 °C 不可超過(guò)1 小時(shí)， 以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

　　16 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度?

　　冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

　　17 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染? 細(xì)胞污染的種類(lèi)可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染之*方法。

　　18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理?

　　直接滅菌后丟棄之。

　　19 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀?

　　不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專(zhuān)家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無(wú)法以其外觀分辨之。

　　20 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響?

　　支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

　　21 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)， 該如何處理?

　　直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。

　　22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤(pán)如何保持清潔?

　　定期(至少每?jī)芍芤淮? 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。

　　23 為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 顏色會(huì)偏暗紅色， 且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性?

　　培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)， 可以通入無(wú)菌過(guò)濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。

　　24 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同?

　　不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長(zhǎng)差異。

　　25 購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形?

　　研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心， 應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

　　26 購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因?

　　研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳， 常見(jiàn)原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80 °C 太久。

　　27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因?

　　冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。